Artikelnummer GC-050-001
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T-Vector System

BESCHREIBUNG

Das Klonieren von PCR-Produkten mit Hilfe eines Plasmid- T-Vectors ist eine einfache und etablierte Methode(1-4).  Diese Methode nutzt den Vorteil der terminalen Transferaseaktivität einer Taq-Polymerase (5). Dieses Enzym hängt eine einzelne Deoxyadenosin   base  an das 3´-Ende ihrer Reaktionsprodukte. Diese PCR-Produkte können direkt in einen Vector eingebracht werden, welcher einzelne kompatible T-Nukleotid- Überhänge enthält. Der BS-SK-T-Vector ist mit Hilfe einer sehr effizienten Methode mittels terminaler Deoxynucleotidyl- Transferase und ddTTP hergestellt worden. Der T-Vector ist aus dem 2961-bp Vector pBluescript II SK(+) angefertigt worden, indem dieser mit EcoRI geschnitten, die vertieften 3´-Enden aufgefüllt und ein 3´-terminaler Thymidin-Rest an beide Enden angehängt wurde. Diese einzelnen 3´-T-Überhänge an der Einfügestelle verbessern die Effizienz der Ligation eines PCR-Produktes in das Plasmid drastisch, indem die Recirculation des Vectors verhindert wird und die Überhänge eine kompatible Ansatzstelle für PCR-Produkte darstellen, welche mit Hilfe von herkömmlichen hitzestabilen Polymerasen erzeugt wurden. Diese Polymerasen hängen oft in einer Template-unabhängigen Art und Weise einen einzelnen Deoxyadenosin-Rest an das 3´-Ende der amplifizierten Fragmente. Der T-Vector enthält Promotoren für die T7 und T3 RNA-Polymerasen, welche eine Multiple-Cloning-Site flankieren. Zusätzlich enthält der T-Vector die kodierende Region für das α-Peptid des Enzyms β-Galactosidase. Durch die Inaktivierung dieses α-Peptids erhält man rekombinante Klone, die direkt anhand eines Farb-Screenings auf speziellen Indikator-Platten identifiziert werden können. Um die Effizienz des Vectors zu steigern,ist das End-Produkt religiert und die lineare Form aus einem Agarose-Gel gereinigt worden. Dieser Vector kann nicht für die Klonierung von PCR-Produkten verwendet werden, die mit bestimmten DNA-Polymerasen wie z.B. der Pfu-DNA-Polymerase erzeugt wurden, da diese keine terminale Transferase-Aktivität aufweisen. Jedoch kann man mit einer einfachen Inkubation dieser PCR-Produkte mit einer Taq-Polymerase einen 3´-Nukleotid-Überhang anhängen, was die Klonierung dieser PCR-Produkte in den T-Vector ermöglicht


PROTOCOL

1. Briefly centrifuge the T-vector and insert DNA tubes to collect contents at the bottom of the tube.
2. Set up ligation reaction as described above

* Molar ratio of PCR product: vector may optimization as described below

3. Mix the reactions by pipetting. Incubate the reaction 1 hour at room temperature.

Alternatively, if the maximum number of transformants is required, incubate the reactions overnight at 40°C.


NOTE

1. Use GeneCraftLs T4 DNA Ligase in performing T-vector ligations. Other commercial preparations of T4 DNA Ligase may contain exonuclease activities that may remove the terminal deoxythymidines from the vector.
2. 5x Ligation Buffer (without ATP) contains: 250 mM Tris-HCl (pH 7.8); 50 mm MgCl2; 50 mM dithiothreitol.
3. It is very important to vortex the 5x Ligation Buffer before each use.
4. Longer incubation times will increase the number of transformants. Generally, incubation overnight at 4‹C will produce the maximum number of transformants.
5. Use 0.5ml tubes known to have ow DNA-binding capacity.


OPTIMIZING INSERT:VECTOR MOLAR RATIOS

The vector have been optimized using a 1:1 molar ratio of the Control Insert DNA to the vector. However, ratios of 8:1 and 1:8 have been successfully used. If initial experiments with your PCR product are suboptiomal, ratio optimizationmay be necessary. Ratios from 3:1 and 1:3 provide good initial parameters. The concentration of PCR product should be estimated by comparison to DNA mass standards on a gel. The T-vector is approximately 3kb and is supplied at 50ng/µl.


T-VECTOR MULTIPLE CLONING SITE REGION


CONCENTRATION

50 ng/µl


STORAGE TEMPERATURE

- 20°C


pBluescript II SK (+)


REFERENCES

1. Trower, M.K. and Elgar G.S. PCR cloning using T-vectors. Methods in Molecular Biology, Vol. 31: Protocols for Gene Analysis, 1994 Human Press Inc., Totowa, NJ
2. Mead, D.A. etal. (1991) A universal method for the direct cloning of PCR amplified nucleic acid. Biotechniques 9: 657-663
3. Marchuk, D.A. etal. (1991) Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 19: 1154
4. Holton, T.A. and Graham, M.W. (1991) A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors. Nucleic Acids Res.19:1156
5. Clark, J.M. (1988) Novel non-templated nucleotide reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Rec. 18:L 9677-9686

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