TthPlus™ DNA Polymerase

TthPlus™ DNA Polymerase ist ein einzelnes 92 kDa grosses Polypeptid mit einer 5`-3`- Exonuklease-Aktivität, jedoch ohne eine 3`-5`-Exonuklease-Aktivität.
Produkt Artikel-Nr. Packungsgröße Preise
TthPlus™ DNA Polymerase
GC-003-0100
Artikelnummer des Herstellers:
Verfügbarkeit:
100 u
15,00 € *
TthPlus™ DNA Polymerase
GC-003-0250
Artikelnummer des Herstellers:
Verfügbarkeit:
250 u
37,50 € *
TthPlus™ DNA Polymerase
GC-003-0500
Artikelnummer des Herstellers:
Verfügbarkeit:
500 u
75,00 € *
TthPlus™ DNA Polymerase
GC-003-1000
Artikelnummer des Herstellers:
Verfügbarkeit:
1000 u
150,00 € *
TthPlus™ DNA Polymerase
GC-003-5000
Artikelnummer des Herstellers:
Verfügbarkeit:
5000 u
750,00 € *

BESCHREIBUNG

TthPlus™ DNA-Polymerase ist aus dem Stamm Thermus thermophilus isoliert worden. TthPlus™ ist ein einzelnes 92 kDa großes Polypeptid mit einer 5´-3´-Exonuklease- Aktivität, jedoch ohne eine 3´-5´-Exonuklease - Aktivität. Das Enzym katalysiert die Polymerisation von Nukleotiden in doppelsträngige DNA in Anwesenheit von MgCl2. Die Effizienz dieser Polymerase zeigt sich insbesondere bei langen DNA-Fragmenten bis zu 12 kb (unter Verwendung einer Lambda-Phagen-DNA als Template). TthPlus™ DNA-Polymerase ist ebenso dazu geeignet die Polymerisation von DNA mit Hilfe eines RNA-Templates
in Anwesenheit von MnCl2 zu katalysieren. Die Fähigkeit der TthPlus™ auch bei höheren Temperaturen (70°C) ihre Reverse Transkriptase-Aktivität zu behalten, minimiert die Probleme mit ausgeprägten Sekundärstrukturen in RNA-Molekülen, da diese bei diesen hohen Temperaturen nicht stabil sind. Höhere Temperaturen erhöhen außerdem noch die Spezifität der Primerbindung und -verlängerung. In gekoppelten RT-PCR-Reaktionen ist die TthPlusT™ zudem ungefähr 50-100 mal effizienter als eine Taq-Polymerase.


TthPlus™ DNA-Polymerase wird mit 10x RT-Puffer, 5x Amplifikations-Puffer und separatem MnCl2 (25 mM)
und MgCl2 (50 mM) geliefert. Der 5x Amplifikations- Puffer enthält EGTA, welches Mn2+ aus der RT-Reaktion
bindet und damit neutralisiert. Daher ist es nach der RTReaktion nicht nötig den Puffer zu wechseln. Für nachfolgende  Amplifikationen empfehlen wir BioTherm™ oder KlenTherm™ DNA-Polymerase

FEATURES

  • thermostable
  • DNA polymerase activity in the presence of MgCl2
  • reverse transcriptase activity in the presence of MnCl2
  • reverse transcription at elevated temperature minimising secondary structure problems


CONCENTRATION

5 units/µl


UNIT DEFINITION

One unit is defined as the amount of enzyme that incorporates 10 nmoles of dNTPs into acid-insoluble form in 30 minutes at 72°C under the following reaction conditions: 25 mM TAPS buffer (Tris-(hydroxymethyl)-methyl- amino-propanesulfonic acid, sodium salt) pH 9.3 (25°C), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 , 1 mM .-mer-captoethanol, 200 µM dNTPs and 10 µg of calf thymus DNA in a final reaction volume of 50 µl.


STORAGE BUFFER

10 mM K-phosphate buffer pH 7.0 (25°C), 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% glycerol (v/v), 0,1 mg/ml BSA


STORAGE TEMPERATURE

Store TthPlus™ DNA polymerase, preferably at -20°C, in a constant temperature freezer.


10X REACTION BUFER

670 mM Tris-HCl pH 8.8 (25°C), 166 mM (NH4)2SO4, 0.1% Tween 20


5x AMPLIFICATION BUFFER

335 mM Tris-HCl pH 8.8 (25°C), 83 mM (NH4)2SO4, 3.75 mM EGTA, 25% glycerol (v/v), 0.1% Tween 20


EXRTA SOLUTIONS

25 mM MnCl2

50 mM MgCl2

The optimal experimental conditions depend on the system used and they should be individually determined. The Mg2+ or Mn2+ concentrations and the enzyme amount are the limiting factors for an accurate result. Tra-ditionally 5 units of enzyme and a MnCl2 concentration of 1 mM are used for the reverse transcription in a final 50 µl reaction volume. For the amplification 2.5 MgCl2 concentration of 1.5 mM are used for a final reaction volume of 50 µl.


COMPANION PRODUCTS

GeneScript™ reverse transcriptase, BioTherm™ DNA polymerase, KlenTherm™ DNA Polymerase, dNTPs


Comparison of sensitivity of RT-PCR with TthPlus™ DNA polymerase and MMLV-RT


Comparison of RT-PCR with TthPlus™ DNA polymerase and MMLV-RT in 16S-rRNA system


10X ONE-TUBE BUFFER

500 Mm bicine-KOH pH 8.3, 1 M KOAc pH 7.5, 30% glycerol


EXTRA SOLUTION

50 mM Mn/OAc)2


VARIOUS CONDITIONS FOR RT-PCR

Two different buffer system can be used for RT-PCR with TthPlus DNA polymerase. The first system for Tth DNA polymerase consists of 4 buffers: 1. reverse transciption (RT) buffer, 2. PCR (amplification buffer), 3. MnCl2 (supplement for RT buffer), 4. MgCl2 (supplement for PCR buffer). The reaction has to be carried out in two steps: RT and PCR in two different vials.
The second buffer system is so-called one-tube buffer (10x) for one-step RT-PCR. Both reactions (RT and PCR) are carried out in the same buffer and the same vial. The one-tube buffer does not contain Mn(OAc)2. Mn(OAc)2 is provided extra and have to be added to the one-tube buffer before the experiment. The protocol to use our TthPlus DNA polymerase is described below (buffer and polymerase conditions and cycle conditions). It was worked out for real-time RT-PCR by our customer Roboscreen GmbH.


PROTOCOL


REFERENCES

  1. Ruttiman C. Cotara S.M., Zaldivar J. and Vicuna R. (1985) DNA polymerase from the extremly thermophylic bacterium Thermus thermophilus HB-8. Eur. J. Biochemistry, 149, 41-46
  2. Myers T.W. and Gelfand D.H. (1991)Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermo-philus DNA polymerase. Biochemistry, 30, 7661-7666

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